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Trascrizione del RNA nei Procarioti

Posted By ThePublisher on Dic 3, 2016 |


La trascrizione del DNA in RNA e la successiva traduzione del messaggio genetico, ha come obbiettivo ultimo la produzione delle proteine per i quali i geni trascritti codificano.

Il processo, negli eucarioti e in minor modo nei procarioti, è mediato da varie proteine che includono: fattori di trascrizione positivi e negativi, repressori, stabilizzatori. Una proteina molto studiata coinvolta nel processo è la RNA-Polimerasi (Pol).

Rna-Pol mentre trascrive sul DNA

Rna-Pol mentre trascrive sul DNA

La RNA-Polimerasi , si lega al doppio filamento di DNA da trascrivere solo in presenza di specifiche sequenze segnale. Queste ultime citate vengono chiamate sequenze di inizio. Il posizionamento della Polimerasi nel suo sito di inizio è mediato da una subunità dell’enzima stesso chiamata sigma70 che a sua volta è composta da subunità più piccole e specifiche per le sequenze di inizio.

La RNA-Polimerasi, giunta nei pressi di una sequenza di inizio, effettua un appaiamento mediato da interazioni a idrogeno con le basi del filamento che non verrà usato come stampo e con alcuni elementi del promotore come l’UP-element. Questo legame garantisce una maggiore stabilizzazione del complesso RNA-Polimerasi&DNA.

Inoltre possono essere presenti diversi fattori proteici che possono destabilizzare o, al contrario, stabilizzare il legame. Come regola generale possiamo dire che maggiore è la stabilità del legame, maggiore sarà la possibilità che quel gene verrà trascritto.

La RNA Polimerasi una volta legata al DNA in uno stato definito “chiuso”, può andare incontro a modificazioni strutturali che la portano ad assumere una forma “aperta”. La forma aperta, ha maggiore affinità con il DNA, quindi una volta oltrepassato questo punto, esclusa la presenza di repressori a valle del gene, l’oloenzima procederà con l’inizio della trascrizione. Questo passaggio viene definito come evasione dal promotore, e con l’inizio della vera e propria trascrizione la Polimerasi perde la subunità sigma e alcuni fattori che sono stati necessari esclusivamente nella parte iniziale della trascrizione.

Una considerazione importante è che, l’oloenzima nella sua isoforma “chiusa”, dissocia facilmente dal DNA mentre la forma aperta, molto più stabile, potrà solo proseguire nella trascrizione.

Le principali caratteristiche dell’isoforma “aperta” dell’oloenzima sono principalmente l’apertura di una bolla replicativa che permette la separazione del filamento stampo dal secondo che non verrà usato come stampo ma solo come guida.

Durante la fase iniziale, l’incorporamento dei primi 10 nucleotidi è un processo relativamente inefficente. Infatti la RNA-Polimerasi rilascia piccoli frammenti di RNA, per poi cominciare la sintesi di nuovo. Si ipotizza che questi primi 10 ribonucleotidi garantiscano la stabilità necessaria all’oloenzima per “scappare” dal promotore e proseguire cosi la trascrizione dei geni a valle. Questi piccoli frammenti di RNA rilasciati vengono detti RNA abortivi (<10 ribonucleotidi). Prima che la Polimerasi riesca a “scappare” dal suo promotore, esegue vari di cicli di inizio sintesi e aborto per cui sono stati ipotizzati 3 modelli di funzionamento:

  • Escursione transitoria (traslocazione della Polimerasi avanti e indietro)
  • A bruco (un elemento mobile all’interno della polimerasi permette alla testa di avanzare e successivamente viene richiamata nella posizione iniziale in caso di aborto della trascrizione)
  • Accartocciamento (il DNA viene accumulato formando dei rigonfiamenti che interagiscono con l’enzima)

Grazie ad alcuni esperimenti il modello più accreditato è quello dell’accartocciamento dato che è stato notato che la RNA-Polimerasi permane stazionaria sul promotore durante questo frangente.

La RNA-Polimerasi batterica, è dotata di “proofreading”, il che vuol dire che ha la capacità, in caso di un errata incorporazione del NTP (Nuclotide trifosfato), di bloccarsi, rimuovere il nucleotidie non appaiato correttamente e continuare la sintesi dell’RNA. Ovviamente l’efficienza di questo processo è inferiore alla trascrizione dato che l’enzima deve sostare per un arco di tempo maggiore nel sito di aberrazione.

I meccanismi con cui la RNA-Polimerasi esplica la sua attività di proofreading sono 2:

editing pirofosfoliticoediting idrolitico.

Attraverso l’editing pirofosfolitico, semplicemente l’enzima usa il suo sito catalitico per promuovere la reazione opposta, quindi la rimozione del nucleotide errato. Nell’editing idrolitico l’enzima si muove di qualche nucleotide a monte dell’errore e rimuove una serie di nucleotidi, tra cui quello/i errato/i. L’editing idrolitico è stimolato da fattori Gre che servono anche da stimolatori dell’allungamento, quindi promuovono l’avanzamento della trascrizione.

Durante la sintesi del nuovo filamento la Polimerasi può imbattersi in siti in cui c’è un evidente danno al DNA. Tecnicamente la meccanica dell’enzima non permetterebbe di superare questi errori, ma un eventuale stallo della polimerasi in un sito provocherebbe anche il blocco di tutte le altre polimerasi a monte.

Biosgna ricordare che il DNA viene letto e trascritto ad un ritmo costante, da più polimerasi, specialmente famiglie multigeniche che codificano proteine fondamentali per la cellula.

A questo punto entrano in gioco degli enzimi di riparazione del DNA ed endonucleasi (Uvr(A)BC per esempio). Tutti quesi fattori necessari al sanamento del danno presente vengono reclutati da una proteina chiamata TRCF. Quest’ultima citata ha un’attività ATPasica, e svolge la sua attività legandosi a monte del punto in cui la Polimerasi è bloccata, e attingendo la propulsione dal consumo di ATP collide contro la Polimerasi in stallo. Questa collisione provoca o il proseguimento della Polimerasi oppure, in molti dei casi, il distacco del complesso ternario, RNA Polimerasi, DNA stampo e del trascritto RNA.

Adesso che la Polimerasi sta procedendo lungo il filamento di DNA, per svolgere la sua trascrizione, come riconosce il momento in cui deve terminarla?

 La terminazione può essere indotta da una proteina a forma di anello chiamata Rho. Quindi le modalità di terminazione possono essere Rho dipendente e Rho indipendente.

 Il meccanismo di azione dei Rho-dipendenti non è stato ancora chiarito ma si sa che la Rho ha un attività ATP-asica e sembra svolga un attività simile a TRCF. Rho si lega a siti specifici rut sul DNA che sono tratti di circa 40 nucleotidi che non si chiudono in una struttura secondaria.

Al contrario i Rho indipendenti sono anche detti elementi intrinsechi dato che non hanno bisogno di altri fattori per indurre la terminazione. Queste sono seguenze invertite (circa 20 nucleotidi) che una volta che vengono trascritte, causa degli appaiamenti complementari formano delle forcine nel RNA di nuova sintesi. Queste agiscono da terminatori separando il complesso di allungamento. La forcina ricca di appaiamenti di GU (3 legami a idrogeno) è un efficente terminatore solo quando nello stampo del sito attivo contemporaneamente sono presenti sequenze di AU (2 legami a idrogeno) più deboli delle GU e quindi l’RNA viene spinto a dissociare dalla Polimerasi.


Blibliografia

Molecular Biology of The Gene, 7th Edition – Watson, Baker, Bell, Gann, Levine, Losick. (Chapter – Mechanisms of Trascription)